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Science重磅!CRISPR領域兩大“宗師”合作,深度解析單堿基編輯器脫靶機制

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Science重磅!CRISPR領域兩大“宗師”合作,深度解析單堿基編輯器脫靶機制

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【摘要】:
近日,基因編輯領域兩位“宗師”David Liu及Jennifer A. Doudna合作,在《Science》首次揭開了一種“最有前途”的堿基編輯器的3D結構,為調整堿基編輯器、使之在應用過程中更加靈活和可控提供了路線圖。

2012年,基因編輯領域兩大先驅Jennifer A. Doudna和Emmanulle Charpentier合作發布了基因編輯史上的里程碑論文,為世界帶來了革命性的CRISPR-Cas9系統。8年來,這把“基因魔剪”以驚人的速度在農業、藥物開發和醫學等領域得到廣泛應用,并衍生出一系列基因編輯工具,成為人類改寫自然遺傳密碼的首選基因組編輯器

然而,此類技術往往無法在高效替換DNA特定堿基的同時保證DNA雙鏈不斷裂,另外,脫靶效應也阻礙該技術在生命科學領域的進一步應用。

近日,基因編輯領域兩位“宗師”David Liu及Jennifer A. Doudna合作,在《Science首次揭開了一種“最有前途”的堿基編輯器的3D結構,為調整堿基編輯器、使之在應用過程中更加靈活和可控提供了路線圖

新版堿基編輯器“工作效率”提升1170倍

腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)是DNA的基本構成單元,按照A-T、C-G的配對形式搭建起了DNA的雙螺旋結構。

2016年,David Liu開發出首個單堿基編輯器,能夠在不切割DNA的情況下,靶向并結合DNA,將C-G堿基對替換為T-A堿基對。一年后,該堿基編輯器得到進一步優化,可將A-T堿基對轉換回G-C堿基對。在人類遺傳病中,該技術有望糾正大約60%(超過15000種)的致病單堿基變異

在DNA中沒有脫氨基酶的情況下,大腸桿菌tRNA腺苷脫氨酶(TadA)能夠與Cas9蛋白質融合進化成ABE7.10,催化脫氧腺苷的靶向脫氨。在此基礎上,ABE7.10變體可被進一步改進成為截短版本的miniABEmax以及ABE8e,后者是最新版本的腺嘌呤堿基編輯器(ABE),能夠編碼單個TadA域(TadA-8e),并與八個測試的Cas效應器廣泛兼容。

無論是ABE7.10還是miniABEmax,早期的腺嘌呤堿基編輯器(ABE)效率都很低。然而,最新的ABE8e卻快到令人驚訝,對DNA的脫氨基速率比ABE7.10和miniABEmax分別高出590倍和1170倍

活躍的脫氨酶蛋白是造成脫靶的“罪魁禍首”

盡管ABE8e能夠在15分鐘內完成近100%的預期基礎編輯,但是這也意味著,ABE8e可能更容易針對無關的DNA片段進行編輯,造成脫靶效應

為了解決這個問題,研究人員利用冷凍電子顯微鏡(Cryo-EM)成像技術,以3.2埃的分辨率解析了ABE8e結合DNA時的3D結構。其中,目標腺嘌呤被設計用來捕捉催化構象的模擬物所取代。

ABE8e捕獲DNA時的Cryo-EM結構

研究人員觀察到,ABE8e之所以具有更高的運行效率,是因為與此前版本的堿基編輯器相比,脫氨酶蛋白在兩個點位上存在突變,這讓蛋白質能夠更緊密地抓取DNA,并更有效地將G替換為A。

該報告的共同第一作者、亞利桑那州立大學助理教授Audrone Lapinaite說:“這項研究讓我們了解到,這一堿基編輯器實際上是以兩個獨立模塊運行:一方面Cas9模塊提供特異性,另一方面存在一個催化模塊提供活性。這為我們提供了一種思考Cas9融合蛋白的方法,使我們知道了Cas9的哪個區域更適合融合其他蛋白。”

活性檢測表明, ABE8e之所以容易產生更多的脫靶編輯,是因為與Cas9融合的脫氨酶蛋白始終處于活躍狀態。在dCas9找到目標之前,會不斷結合并釋放成百上千個DNA片段。始終處于激活狀態的脫氨酶就像一個失控的大炮,不等dCas9完全匹配到目標就已經對著堿基“開火”了。

加州大學伯克利分校的博士后研究員Gavin Knott博士說:“現在,我們不僅可以了解基因編輯器何時可以使用,什么時候不可以使用,還可以設計下一代基礎編輯器,使它們更好,更適合臨床。”

參考資料:

1.DNA capture by a CRISPR-Cas9–guided adenine base editor.

2.Cryo-EM Captures CRISPR-Cas9 Base Editor in Action.

3.美國博德研究所David Liu:腺嘌呤堿基編輯器(ABE)

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